Жидкая биопсия в персонализированном лечении онкологических пациентов 

Жидкая биопсия является неинвазивным методом для характеристики генома опухоли пациента на основании периферической крови путем анализа циркулирующей опухолевой ДНК (ctDNA). Жидкие биопсии имеют огромный потенциал для молекулярного профилирования, прогнозирования и мониторинга опухолей. Они может обеспечить значительное улучшение персонализированного ведения пациентов с онкологическими заболеваниями. В настоящее время эта область находится в интересном периоде трансформации, когда анализ ctDNA начинает применяться в клинической практике, хотя о его биологии еще предстоит узнать многое. В данной обзорной статье кратко представлены современные технологии и появляющиеся новые концепции, которые могут способствовать дальнейшему развитию области применения жидкой биопсии.

Что такое жидкая биопсия?

Уже в течение нескольких лет в центре внимания персонализированной медицины рака все больше находится новый аналитический метод с большим потенциалом для применения в будущем - так называемая жидкая биопсия («Liquid Biopsy»). Однако с точки зрения патологии термин «жидкая биопсия» является неверным, поскольку речь идет о чисто молекулярно-аналитическиом методе, а не биопсия в прямом смысле. В идеале этот анализ крови дает ту же диагностическую и прогностическую информацию, что и классическая биопсия ткани: Опухолевые клетки высвобождают свою генетическую информацию в кровь, и их можно исследовать на предмет наличия геномных изменений. Эти высвобождаемые из опухоли нуклеиновые кислоты встречаются в крови только в минимальных количествах, поэтому их обнаружение стало возможным только благодаря разработке высокочувствительных методов, таких как секвенирование нового поколения (NGS). Термин «жидкая биопсия» относится, главным образом, к изучению бесклеточных нуклеиновых кислот - в основном циркулирующей свободной ДНК («circulating free DNA», cfDNA) из периферической крови. Циркулирующая свободная ДНК, полученная из опухолевых клеток, также называется циркулирующей свободной опухолевой ДНК – цоДНК («circulating free tumor DNA», ctDNA). Количество цоДНК, выделяемых из опухоли в кровь, зависит от типа опухоли, ее локализации, васкуляризации, размера и распространенности. При этом фрагменты ДНК имеют в среднем только 160 очень коротких базовых пар, поэтому считается, что ДНК происходит главным образом из апоптотических клеток. В цоДНК могут быть обнаружены специфические для соматических опухолей генетические изменения, такие как точечные мутации, делеции и амплификации. Жидкая биопсия также позволяет обнаруживать бесклеточную РНК митохондриальной опухоли (cfmiRNA) и экзосомы. При этом речь идет о везикулах, которые могут содержать различные компоненты опухолевых клеток, такие как нуклеиновые кислоты или белки, и которые имеют огромный потенциал в качестве новых биомаркеров. В принципе, циркулирующие опухолевые клетки («circulating tumor cells», CTC) из крови также подходят для молекулярной диагностики опухолей. Однако даже в случае метастатических опухолей они обычно присутствуют в крови в очень небольших количествах и их трудно накапливать, поэтому в настоящее время они не имеют значения в молекулярной диагностике, проводящейся на основе крови.

ЦоДНК, полученная из периферической крови, используется для онкогенной диагностики (мутационного анализа) . Для этой цели доступны многочисленные методы анализа, которые можно приблизительно подразделить на те, с помощью которых можно специально исследовать один или небольшое количество геномных вариантов, и те, которые охватывают более широкий спектр. Целевые анализы полезны для обнаружения определенных известных вариантов последовательности в одном гене или в небольшом определенном количестве генов. Эти целевые анализы используются, например, для выявления мутаций, связанных с ответом на терапию определенным препаратом (например, варианты последовательности EGFR у пациентов с немелкоклеточным раком легких). Напротив, в анализах с широким спектром используются подходы, основанные на NGS, для выявления большого количества вариантов последовательностей в нескольких генах (> 50 генов). Такие анализы широкого спектра используются для различных типов опухолей.

Возможности использования и потенциал жидких биопсий

Метод жидкой биопсии используется в онкологии и связанной с ней молекулярной диагностике опухолей для различных целей. Биопсия крови у онкологических пациентов позволяет получить потенциально полезную информацию о диагностических, предикативных и, возможно, прогностических биомаркерах. Важнейшими областями применения являются определение терапевтических структур-мишеней и механизмов резистентности. Хотя наблюдение за прогрессированием заболевания (мониторинг опухоли) все еще находится на ранней стадии, в настоящее время оно становится многообещающим методом наблюдения за онкологическим пациентом, например, для оценки состояния ремиссии и раннего выявления и лечения пациентов с рецидивом или прогрессированием заболевания. Еще не полностью подтвержденные применения жидкой биопсии включают оценку риска опухолевых заболеваний, скрининг здоровых людей для раннего выявления рака, дифференциальную диагностику обнаруженных злокачественных новообразований, определение прогноза и анализ всего спектра гетерогенности опухолей.

В целом, анализы цоДНК в идеале должны проводиться в случае клинически выраженного прогрессирования заболевания, а не до тех пор, пока пациент все еще реагирует на целевую терапию. Если опухоль реагирует на терапию, концентрации цоДНК в крови пациента обычно снижаются, и поэтому обнаружение цоДНК становится намного более сложным.

Предиктивная диагностика мутаций на основе крови для оценки таргентной терапии («сопутствующая диагностика»)

Перед использованием таргентной терапии настоятельно рекомендуется диагностика молекулярных мутаций («сопутствующая диагностика»). Анализ с помощью жидкой биопсии подходит для этой цели, если обычная биопсия или цитологический материал недостаточны из-за низкого содержания опухолевых клеток для диагностики генеза опухоли. Кроме того, этот метод может использоваться в труднодоступных очагах опухоли или у пациентов с сопутствующими заболеваниями, которые делают невозможным инвазивное взятие проб. В ходе заболевания и при прогрессировании опухоли часто встречаются множественные опухолевые участки и метастазы, которые могут быть генетически гетерогенными. В данном случае жидкая биопсия обладает преимуществом отграничения освобожденной цоДНК от всех проявлений опухоли и, таким образом, обеспечения репрезентативного молекулярно-генетического профиля опухоли даже в случае генетической гетерогенности (см. таблицу).

Оценка клинической пользы анализа цоДНК по сравнению с обычными биопсиями опухолевой ткани для комплексного генотипирования опухоли еще не является окончательной, поскольку отсутствуют проспективные данные клинических исследований. В настоящее время применение на практике жидких биопсий ограничивается выявлением мутаций рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) у пациентов с немелкоклеточным раком легких и мутаций саркомы Кирстен-рат (KRAS) у пациентов с колоректальной карциномой.

Жидкие биопсии имеют высокую положительную, но низкую отрицательную прогностическую ценность. Например, обнаружение мутации EGFR из крови можно использовать в качестве прогностического маркера для прогнозирования ответа на таргентную терапию ингибиторами тирозинкиназы, но при отсутствии мутации EGFR в крови образец ткани обязательно должен быть дополнительно изучен. Случаи, в которых мутация EGFR не обнаруживается при жидкой биопсии, но обнаруживается при биопсии тканей опухоли, относительно распространены, и, следовательно, при отсутствии признаков мутации в крови обязательно следует искать подтверждение ее наличия в опухолевой ткани.

Жидкая биопсия в молекулярной диагностике в условиях резистентности

Интересной и многообещающей областью применения жидкой биопсии является выявление возникающих мутаций резистентности при прогрессировании опухоли после терапии с целью адаптации дальнейшего лечения. Жидкая биопсия играет важную роль в поиске мутации резистентности к p.T790M в гене EGFR при таргентной терапии немелкоклеточного рака легких. Дополнительный молекулярный тест для обнаружения этой мутации устойчивости к p.T790M-EGFR может быть выполнен быстро и надежно на основе цоДНК из плазмы крови. Однако чувствительность этого метода составляет всего около 60-70%, поэтому в этой ситуации при отсутствии доказательств мутации устойчивости к EGFR следует сделать повторную биопсию или забор цитологического материала из прогрессирующего очага опухоли.

Молекулярный мониторинг опухолей

Жидкая биопсия может изменить не только молекулярную диагностику прогностических биомаркеров, но и мониторинг динамики заболевания. Актуальным для мониторинга и выбора терапии является исследование генов, которые уже были определены как значимые с помощью классического анализа опухолевой ткани - например, драйверные мутации в генах EGFR, KRAS или BRAF. Если специфичные для опухоли мутации известны из предыдущих молекулярно-патологических исследований первичной опухоли, жидкую биопсию можно использовать для диагностики рецидивов, например, в случае неясных результатов визуализированных методов исследования.

Мониторинг опухолей с помощью жидкостной биопсии особенно интересен, поскольку, с одной стороны, он может обнаруживать рецидивы очень рано, а с другой стороны, он также может быть использован для расшифровки факультативно измененного молекулярно-генетического профиля рецидивирующей опухоли. Если во время терапии обнаруживаются мутации резистентности, прогноз пациента может быть улучшен путем изменения таргентной терапии. Примерами использования жидкой биопсии в мониторинге являются контроль терапии у пациенток с раком молочной железы и у пациентов с раком легких. Для этих опухолевых образований удалось продемонстрировать, что увеличение известной драйверной мутации в крови сопровождается рецидивом. Таким образом, использование жидких биопсий позволяет осуществлять мониторинг терапии в режиме реального времени. Однако клиническая значимость жидкой биопсии в этом контексте все еще слишком ограничена, чтобы оправдать ее широкое использование в практической диагностике.

Жидкая биопсия как прогностический параметр

Опухоли, которые выделяют цоДНК в периферическую кровь на стадии первичной опухоли (UICC I, II), имеют худший прогноз, чем те, при которых цоДНК не обнаруживается в крови. Следовательно, в будущем жидкая биопсия может играть все более важную прогностическую роль в дифференциации цоДНК -позитивных и цоДНК -негативных опухолей. Такое молекулярное стадирование может повлиять на решение в пользу или против проведения адъювантной терапии. В какой степени эта концепция подходит для использования в онкологической практике, еще неизвестно; необходимы дальнейшие клинические исследования.

Преимущества жидкой биопсии

Наиболее важное преимущество жидкой биопсии очевидно: вместо инвазивного забора образца достаточно взять образец крови для мутационного анализа опухоли (см. таблицу). По сравнению с классической биопсией ткани, жидкие биопсии гораздо более просты в заборе и, следовательно, менее рискованны и менее обременительны для пациента, особенно когда необходимо периодически исследовать образцы тканей, прежде всего, в рамках последующего наблюдения. Таким образом, данный метод особенно подходит для видов рака, при которых биопсия иглой сопровождается риском, например, при опухолях легких. Благодаря простой процедуре забора проб жидкая биопсия может быть проведена последовательно без каких-либо проблем и, таким образом, позволяет документировать процесс. Теоретически, такие жидкие биопсии дают полную информацию об опухолевой нагрузке у пациента, так как этот метод может использоваться для исследования всей опухолевой ДНК, присутствующей в кровотоке пациента. Это еще одно преимущество по сравнению с биопсией ткани, при которой в конкретном анатомическом месте исследуется только одна область поражения, которая не обязательно является репрезентативным из-за неоднородности опухоли.

Жидкие биопсии и биопсии тканей сравнимы с точки зрения технической сложности, так что никакого существенного увеличения затрат на их проведение не возникает.

Проблемы и ограничения жидкой биопсии

Жидкая биопсия в настоящее время используется в рутинной диагностике только для решения отдельных клинических задач, поскольку данный метод еще имеет некоторые неточности, препятствующие его широкому использованию.

Бесклеточная циркулирующая опухолевая ДНК обнаруживается только примерно у 75% пациентов с метастатической опухолевой болезнью, при этом имеются значительные различия между различными формами опухоли и стадиями опухоли. Концентрация цоДНК особенно низка при карциномах почечных клеток, предстательной и щитовидной железы, а также при опухолях головного мозга (из-за гематоэнцефалического барьера) даже при метастазировании, поэтому диагностировать ее не всегда удается. Даже у пациентов с локализованным опухолевым поражением (стадия I) частота обнаружения цоДНК значительно ниже.

Другая проблема с анализом цоДНК в обычной молекулярной патологии заключается в том, что до сих пор не существует маркера, который мог бы надежно отличить цоДНК из опухолевых клеток от сцДНК из здоровых клеток. Только обнаружение мутации, известной по первичной опухоли, дает уверенность в том, что исследование сработало, и результат теста имеет клиническую значимость. Однако если в жидкой биопсии не обнаружено никакой известной мутации, то либо в крови отсутствует цоДНК, либо чувствительность метода анализа слишком низкая для обнаружения существующей цоДНК. Также проблематичным в этом контексте является потенциальное высвобождение мутированной ДНК из доброкачественных, воспалительных наслаивающихся поражённых участков (например, меланоцитарный невус кожи, кишечный полип). Третье ограничение заключается в том, что обнаружение цоДНК в крови не позволяет сделать выводы о том, где располагается опухоль и какой орган поражен. Это должно быть дополнительно изучено при помощи визуализационной диагностики.

Открытые вопросы в исследовании

Обнаружение транслокаций (слияний генов) лучше всего проводить на уровне мРНК из крови. Однако циркулирующая мРНК свободной опухоли в крови состоит из очень коротких фрагментов (в среднем 40 базовых пар), которые не подходят для выявления мутаций. Таким образом, анализ мРНК опухоли в настоящее время проводится на экзосомах, но этот метод еще не готов для использования в клинической практике. Все это показывает, что, хотя метод ликвидной биопсии имеет много применений, он еще не созрел и все еще находится на стадии тестирования. Из-за методологических ограничений жидкие биопсии, предположительно, никогда не достигнут качества и информативности исследований опухолевой ткани, но дополняют их и имеют свое значение в персонализированной молекулярной диагностике и мониторинге опухолевых заболеваний. Другим критическим аспектом все еще является отсутствие стандартизации технологий выделения и анализа цоДНК и управления качеством обработки образцов (см. таблицу).

Резюме и перспективы

Рак - это сложное, гетерогенное и динамическое заболевание, на которое влияют генетические факторы и факторы окружающей среды. Разработка простых, надежных и стабильных неинвазивных методов молекулярно-генетической диагностики опухолевых профилей или терапевтических структур-мишеней в форме так называемых жидких биопсий является решающим шагом для удовлетворения требований персонализированной медицины. Современные данные указывают на большой потенциал жидкой биопсии в диагностике молекулярных опухолей, например, для классификации онкологических больных в группы лечения («сопутствующая диагностика»). Кроме того, можно использовать жидкую биопсию в качестве суррогатного метода для мониторинга прогрессирования заболевания и ответа на терапию в режиме реального времени (мониторинг опухоли). Простой и частый забор жидких биопсий дает много преимуществ по сравнению с классическими тканевыми биопсиями. В частности, рецидив опухоли и прогрессирование заболевания могут быть обнаружены на ранней стадии, и терапия может быть быстро адаптирована. Еще одно рутинное использование жидкой биопсии заключается в раннем выявлении и предиагностической оценке риска развития рака («скрининг»).

Жидкая биопсия и классическая биопсия ткани дополняют друг друга в молекулярном анализе опухолей. В будущем метод жидкой биопсии может даже частично заменить классические биопсии тканей. Однако в настоящее время эта процедура еще недостаточно разработана для широкого использования в рутинной диагностике. В частности, клиническая интерпретация результатов представляет серьезные проблемы для использования данного метода в повседневной клинической практике. Однако ожидается, что растущее понимание биологической основы цоДНК и других многообещающих биомаркеров периферической крови, а также новых методов анализа прочно утвердит жидкую биопсию в повседневной клинической практике, что значительно улучшит ведение онкологических пациентов.

Следует запомнить

• Жидкая биопсия представляет собой молекулярно-генетический анализ циркулирующей опухолевой ДНК (цоДНК) из периферической крови для диагностики, определения прогностических маркеров (сопутствующей диагностики) и, возможно, для контроля динамики опухолевых заболеваний.
• Дополнительные возможности применения включают раннее выявление рака (скрининг), а также неинвазивное отслеживание опухолевой нагрузки с возможным мониторингом мутаций.
• Жидкостная биопсия и классическая биопсия тканей дополняют друг друга при исследовании молекулярно-генетических изменений в опухолях.
• Жидкие биопсии имеют высокую положительную прогностическую ценность: при выявлении мутаций они имеют такое же высокое значение, как и биопсия ткани.
• Жидкие биопсии имеют низкую отрицательную прогностическую ценность: при отсутствии мутации (дикий тип) они не могут быть интерпретированы.
• Все еще неясная биологическая основа цоДНК, например, ее стабильность или огромная изменчивость концентраций цоДНК в различных опухолевых образованиях и стадиях опухоли, являются проблематичными.

По этим причинам используемые в настоящее время технологии жидкой биопсии все еще слабо стандартизированы и, следовательно, пока не подходят для широкого использования в рутинной диагностике.

Источник - http://www.aerzteblatt.de

Поделиться: